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???metadata.dc.type???: Tese
Title: Isolamento e caracterização molecular de duas novas cepas de Anaplasma marginale e estabelecimento de linhagens de células embrionárias do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus
Other Titles: Isolation and molecular characterization of two new strains of A. marginale and establishment of embryonic cell lines from the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus.
???metadata.dc.creator???: Baêta, Bruna de Azevedo 
???metadata.dc.contributor.advisor1???: Fonseca, Adivaldo Henrique da
First advisor-co: Zweygarth, Erich
???metadata.dc.contributor.referee1???: Piranda, Eliane Mattos
???metadata.dc.contributor.referee2???: Decker, Lygia Maria
???metadata.dc.contributor.referee3???: Baldani, Cristiane Divan
???metadata.dc.contributor.referee4???: Santos, Huarrisson Azevedo
???metadata.dc.description.resumo???: No primeiro capítulo foram isoladas e caracterizadas duas novas cepas de Anaplasma marginale oriundas do município de Seropédica, RJ, em linhagem de células de carrapato Ixodes scapularis (IDE8), possibilitando novos estudos no diagnóstico com a utilização de cepas locais. No segundo capítulo foram desenvolvidas e caracterizadas as primeiras linhagens de células embrionárias de Rhipicephalus (Boophilus) microplus oriundas de cepa brasileira. As cepas de A. marginale foram obtidas a partir de sangue de dois bezerros naturalmente infectados pertencentes à Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), Seropédica. Após isolamento, as cepas foram caracterizadas morfologicamente, através da microscopia de luz e molecularmente através do semi-nested PCR do gene msp1α. Duas cepas de A. marginale foram isoladas e nomeadas como AmRio1 e AmRio2. Pequenas colônias foram observadas em lâminas de citocentrífuga coradas com Giemsa 1:10, de cada isolado, 60 dias após o início da cultura. Análises de uma repetição em tandem de MSP1a da cepa AmRio1 resultou em uma nova sequência (nomeada de 162) com um aminoácido diferente. O resultado da análise filogenética demonstrou que as cepas de A. marginale a partir do Brasil e Argentina formam dois grandes clusters. Para o estabelecimento das linhagens de R. (B.) microplus, os carrapatos foram provenientes de cepa mantida em bezerros no Laboratório de Doenças Parasitárias, UFRRJ, Seropédica. No 13° dia de postura, a massa de ovos foi esterilizada, macerada, filtrada e centrifugada a 200 xg por 10 minutos. O “pellet” foi suspenso em meio Leibovitz’s L15 e dividido em 6 frascos de 25 cm2, dos quais 3 contaminaram, um foi depositado no banco de células do Instituto Pirbright e outros 2 foram caracterizados no presente estudo (linhagens BMEBR1 e BMEBR2) através da análise molecular do gene 16S DNAr (PCR), curva de crescimento e microscopia de luz e epifluorescência. Com 60 dias de cultivo, as células passaram a apresentar um aspecto confluente, caracterizando a formação da monocamada. Existiu uma completa similaridade (100%) das novas linhagens BMEBR1 e BMEBR2 com R. (B.) microplus do Brasil (EU918178.1), da Costa Rica (EU918179.1), do Paraguai (EU918180.1), entre outros. Ambas as cepas apresentaram crescimento menor que a linhagem de R. (B.) microplus BME/CTVM2 oriunda da Costa Rica. A linhagem BMEBR1 possui maior capacidade fagocítica que as linhagens BMEBR2 e BME/CTVM2. Além disso, essas linhagens possuem características de acidificação, produção de corpúsculo lipídico e estresse oxidativo diferentes entre si. As novas linhagens foram congeladas e descongeladas com sucesso e apresentaram-se estáveis com relação às características morfológicas e de taxa crescimento. Desta forma, estas linhagens podem ser utilizadas em futuros estudos na propagação das novas cepas de A. marginale isoladas.
Abstract: In the first chapter two new strains of Anaplasma marginale derived from the Seropédica, RJ were isolated and characterized in tick cells line of Ixodes scapularis (IDE8), enabling new studies in the diagnosis with the use of local strains. In the second chapter the first lines of embryonic cells of Rhipicephalus (Boophilus) microplus from Brazilian strains were developed and characterized. The strains of A. marginale were from blood of two naturally infected calves belonging to the Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), Seropédica. After isolation, the strains were characterized morphologically by light microscopy and molecularly by nested PCR of msp1α gene. Two strains of A. marginale were isolated and named as AmRio1 and AmRio2. Small colonies were observed in cytospin smears stained with Giemsa’s 1:10, of each of the isolates, 60 days after culture initiation. Analysis of msp1α microsatellite in both strains resulted in a single genotype, genotype E. The amino acid sequence of one MSP1α tandem repeat from the strain AmRio1 resulted in a new sequence (named 162) with one amino acid change. The results of our phylogenetic analysis demonstrated that A. marginale strains from Brazil and Argentina formed two large clusters. In establishing of the strains of R. (B.) microplus, the ticks were from strain kept calves in Parasitic Diseases Laboratory, UFRRJ, Seropédica. After 13 days of laying, the pool of eggs was sterilized, macerated, filtered and centrifuged at 200 xg for 10 minutes. The pellet was suspended in Leibotiz’s L15 medium and divided into 6 flasks of 25 cm2, of which 3 were contaminated, one was deposited in the cell bank of the Pirbright Institute and others two were characterized in the present study (BMEBR1 and BMEBR2 lines) through molecular analysis of the 16S rDNA gene (PCR), growth curve and epifluorescence and light microscopy. Sixty days in culture, the cells began to show confluent aspect, reaching the formation of the monolayer. There was a complete similarity (100%) of new lines BMEBR1 and BMEBR2 with R. (B.) microplus in Brazil (EU918178.1), Costa Rica (EU918179.1), Paraguay (EU918180.1), among others. Both strains showed lower growth than the R. (B.) microplus line from Costa Rica, BME/CTVM2. The BMEBR1 line has increased phagocytic ability that the BMEBR2 and BME/CTVM2 lines. In addition, these strains have acidification characteristics, lipid corpuscle production and oxidative stress different from each other. The new strains were frozen and defrosted successfully, and were stable with respect to morphology and growth rate. Thus, these lines can be used in future studies to propagation of new strains of A. marginale isolated.
Keywords: cultivo in vitro
Anaplasma marginale
Rhipicephalus (Boophilus) microplus
in vitro culture
Anaplasma marginale
Rhipicephalus (Boophilus) microplus
???metadata.dc.subject.cnpq???: Medicina Veterinária
Language: por
???metadata.dc.publisher.country???: Brasil
Publisher: Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
???metadata.dc.publisher.initials???: UFRRJ
???metadata.dc.publisher.department???: Instituto de Veterinária
???metadata.dc.publisher.program???: Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
Citation: Baêta, Bruna de Azevedo. Isolamento e caracterização molecular de duas novas cepas de Anaplasma marginale e estabelecimento de linhagens de células embrionárias do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus. 2015. [98 f.]. Tese( Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias) - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, [Seropédica - Rio de Janeiro] .
???metadata.dc.rights???: Acesso Aberto
URI: https://tede.ufrrj.br/jspui/handle/jspui/2753
Issue Date: 20-Feb-2015
Appears in Collections:DOUTORADO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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