???item.export.label??? ???item.export.type.endnote??? ???item.export.type.bibtex???

Please use this identifier to cite or link to this item: https://tede.ufrrj.br/jspui/handle/jspui/1922
???metadata.dc.type???: Dissertação
Title: Silenciamento gênico por miRNA do transportador OsAMT1.3 e seu efeito sobre a eficiência de absorção de amônio (Oryza sativa L.)
Other Titles: Transporter OsAMT1.3 gene silencing by miRNA and its effects in the ammonium efficiency uptake (Oryza sativa L.)
???metadata.dc.creator???: Neves, Marcela Jacques de Lemos 
???metadata.dc.contributor.advisor1???: Souza, Sonia Regina de
First advisor-co: Santos, Leandro Azevedo
???metadata.dc.contributor.referee1???: Souza, Sonia Regina de
???metadata.dc.contributor.referee2???: Mauad, Munir
???metadata.dc.contributor.referee4???: Ferraz Júnior, Altamiro Souza de Lima
???metadata.dc.description.resumo???: O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito do silenciamento do gene do transportador OsAMT1.3 em arroz sobre a habilidade das plantas em absorver o N-NH4+ através do sistema de alta afinidade, bem como os reflexos sobre o metabolismo de nitrogênio. Para o silenciamento do gene OsAMT1.3 foi usada a tecnologia do miRNA artificial (amiRNA). Para tanto, a sequência codante do gene (cds) OsAMT1.3 é inserida no sistema WMD3 que indica sequências de amiRNA’s para silenciar o próprio OsAMT1.3. A inserção do amiRNA foi feita por PCR usando o vetor pNW55 como molde. O miRNA foi inserido no vetor IRS154 por corte e ligação usando a enzima T4 DNA ligase. O produto da ligação foi introduzido em E. coli por eletroporação. Após a transformação de arroz da variedade Nipponbare mediada por Agrobacterium. A seleção das plantas transformadas foi feita com o antibiótico Higromicina. No total foram obtidas 14 linhagens transformadas. Para confirmar que as plantas mutantes possuiam a construção, foi realizado o teste com a folha bandeira em solução de higromicina. Seis linhagens apresentaram boa produção de sementes e houve uma linhagem com crescimento anormal. Após a multiplicação das linhagens em casa de vegetação, foram selecionadas as linhagens L1, L2 e L6 para os experimentos de análise dos efeitos do silenciamento do gene OsAMT1.3. Primeiramente, as linhagens selecionadas foram avaliadas quanto ao nível de silenciamento do gene OsAMT1.3. As linhagens de arroz transformadas apresentaram maior nível de silenciamento do gene OsAMT1.3 quando comparadas às plantas controle, no entanto, diferentes níveis de silenciamento foram observados. A linhagem L1 apresentou menor nível de silenciamento do gene OsAMT1.3, enquanto L2 e L6 apresentaram maior silenciamento. As linhagens L1, L2 e L6 e a planta controle IRS (transformada com o vetor vazio) foram cultivadas em câmara de crescimento até os 30 dias após a germinação, com a aplicação dos seguintes tratamentos: sem N por três dias, ressuprimento com 0,15 mM de N-NH4+ após três dias de privação de N (baixa dose) e 2,0 mM de N-NH4+ constante (alta dose). As linhagens L1, L2 e L6 apresentaram menor absorção de NH4+ com 0,15 mM de N-NH4+ quando comparadas com as plantas controle (IRS), enquanto as plantas cultivadas com 2,0 mM de N-NH4+ não apresentaram diferenças na absorção de NH4+. A expressão dos genes dos transportadores de NH4+ OsAMT1.1, OsAMT1.2 e OsAMT1.3 foi induzido pelo tratamento com 0,15 mM de N-NH4+ nas plantas controle (IRS), enquanto as linhagens transformadas apresentaram repressão dos genes OsAMT1.1, OsAMT1.2 e OsAMT1.3. A menor absorção de NH4+ com 0,15 mM de N-NH4+ causou menor nível de N-NH4+ e N-amino nas raízes das linhagens transformadas, enquanto nas plantas com 2,0 mM de N-NH4+ houve pouca alteração nos conteúdos de N-NH4+ e N-amino. Os resultados indicam que o silenciamento do gene OsAMT1.3 provoca regulação negativa dos transportadores OsAMT1.1 e OsAMT1.2, alterando a absorção de NH4+. Apesar do gene OsAMT1.3 ser menos expresso que os genes OsAMT1.1 e OsAMT1.2, o transportador OsAMT1.3 pode estar envolvido na eficiência de absorção em baixas doses de NH4+.
Abstract: The main goal of this study was evaluate the effect of downregulation of the ammonium transporter OsAMT1.3 in the ammonium uptake through the high affinity system, as well as the effects on nitrogen metabolism. To perform the OsAMT1.3 gene silencing, it was used the artificial micro RNA (amiRNA) technology. In this system, the OsAMT1.3 coding region sequence (cds) is inserted in W marcelaMD3 website and putatives amiRNAs to silencing OsAMT1.3 were made. The amiRNA was inserted by PCR using the pNW55 vector as template. The amiRNA was inserted in the IRS154 vector using the T4 DNA ligase. The IRS154 plus amiRNA was cloned in the E. coli by electroporation. After rice transformation of Nipponbare variety through Agrobacterium and Hygromycin selection, 14 lineages were obtained. Six lineages showed high seed production and only one lineage with abnormal growth. After seed production in a greenhouse, the lineages L1, L2 and L6 were selected to further experiments evaluating the effects of OsAMT1.3 downregulation. First, the lineages selected were evaluated about the levels of OsAMT1.3 downregulation. The rice lineages transformed with amiRNA showed lower level of OsAMT1.3 expression compared to control plants, however, different levels of OsAMT1.3 downregulation was observed. The lineage L1 showed lower levels of OsAMT1.3 downregulation, L2 and L6 showed higher levels of OsAMT1.3 downregulation. The lineages L1, L2 and L6 as well as IRS control plant (transformed with empty vector) were grown in growth chamber at 30 days after germination, and the treatments used were: N starvation for three days, resupply with 0.15 mM of NH4+-N (low level) and 2.0 mM of NH4+-N (high level). The lineages L1, L2 and L6 showed lower NH4+ uptake with 0.15 mM of NH4+-N compared to control plants (IRS), on the other hand, the plants grown with 2.0 mM of of NH4+-N did not show NH4+ uptake differences, except L1. The expression of OsAMT1.1, OsAMT1.2 and OsAMT1.3 ammonium transporters were upregulated with 0.15 mM of NH4+-N in the control plants (IRS); in the lineages L1, L2 and L6 showed downregulation of the OsAMT1.1, OsAMT1.2 and OsAMT1.3 genes. The lower NH4+ uptake with 0.15 mM of NH4+-N resulted in lower levels of NH4+-N and Amino-N in the roots in the lineages, while the NH4+-N and Amino-N in the plants grown with 2.0 mM of NH4+-N was minimally changed. The results indicate that OsAMT1.3 downregulation leads to OsAMT1.1 and OsAMT1.2 downregulation as well, decreasing the NH4+ uptake. Despite the OsAMT1.3 lower expression compared to OsAMT1.1 and OsAMT1.2, the OsAMT1.3 transporter may be involved in the nitrogen uptake efficiency in low levels of NH4+.
Keywords: Ammonium transporter
Gene expression
Artificial microRNA
Transportador de amônio
Expressão gênica
MicroRNA artificial
???metadata.dc.subject.cnpq???: Agronomia
Language: por
???metadata.dc.publisher.country???: Brasil
Publisher: Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
???metadata.dc.publisher.initials???: UFRRJ
???metadata.dc.publisher.department???: Instituto de Agronomia
???metadata.dc.publisher.program???: Programa de Pós-Graduação em Agronomia - Ciência do Solo
Citation: NEVES, Marcela Jacques de Lemos . Silenciamento gênico por miRNA do transportador OsAMT1.3 e seu efeito sobre a eficiência de absorção de amônio (Oryza sativa L.). 2014. 34 f. Dissertação (Mestrado em Agronomia - Ciência do Solo). Instituto de Agronomia, Departamento de Solos, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2014.
???metadata.dc.rights???: Acesso Aberto
URI: https://tede.ufrrj.br/jspui/handle/jspui/1922
Issue Date: 30-May-2014
Appears in Collections:Mestrado em Agronomia - Ciência do Solo

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
2014 - Marcela Jacques de Lemos Neves.pdfDocumento principal424.04 kBAdobe PDFThumbnail

Download/Open Preview


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.